1) W. Saeger, Principles of Nucleic Acid Structure Springer Verlag 1984; 1988

vene k. “Mir” 1987

2) Ch. Cantor, P. Schimmel Biophysical Chemistry. Freeman, San Francisco, CA 1980

vene k. “Mir” 1987

3) Z.A. Shabarova, A.A. Bogdanov Himija Nukleinovõh Kislot “Himija” 1987

4) R. R. Sinden, DNA structure and function. Academic Press 1994 (Molbi õppetoolis, T. Tensoni isiklik koopia)

5) V. A. Bloomfeld, D. M. Crothers, Tinoco, I. Jr. Nucleic Acids Structures, properties, and functions. University Science Books. Sausalito, CA. 2000 (Molbi õppetoolis)

6) The RNA world 2 edition. R. F. Gesteland, T. R. Cech, J. F. Atkins (eds) ColdSpring Harbor Laboratory Press 1999 (Molbi õppetoolis)

üldine sait nukleiinhapete struktuuri kohta näitlike õppematerjalidega:

http://www.imb-jena.de/ImgLibDoc/nana/IMAGE_NANA.html

DNA struktuur:

http://www.umass.edu/microbio/chime/dna/

http://www.worthpublishers.com/lehninger3d/index.html

aluspaarid:

http://www.imb-jena.de/RNA_TINOCO.html

mittekanoonilised aluspaarid RNAs:

http://chem.bgsu.edu/rna/

kasulik link nii aluspaaride kui paljude muude nukleiinhapete struktuuri puudutavates küsimustes on Jena (Saksa) Molekulaarse biotehnoloogia instituudi saidis:

http://www.imb-jena.de/RNA.html

RNA-d sisaldavate kristallstruktuuride loetelu koos PDB lühiaadressidega:

http://www.imb-jena.de/IMAGE_RNA.html

RNA webring sisaldab linke RNA ja RNA laborite kohta:

http://homepages.ed.ac.uk/jeanb/RNAwebring.html

Nukleiinhapped avastas F. Misher 1869 a. (DNA) ja nimetas selle nukleiiniks (leiti tuumast) hiljem osutus aine happeks.

Nukleiinhapete osa päriliku info säilitamisel selgus XX saj. 30. aastatel, veenvad katsed Avery (1944), Hershey ja Chase (1952).

DNA struktuurimudel, mis on klassikaliseks näiteks, kuidas molekuli struktuuri tundmine viib tema bioloogiliste funktsioonide mõistmisele: Watson ja Crick, 1953 (vt. J. D. Watson Kaksikspiraal, Loomingu Raamatukogu, 1972?).

Nukleiinhapped struktuurse komponendina (rRNA) 50. aastatel

Nukleiinhapete osa informatsiooni ülekandel 50. lõpp

mRNA Jacob & Monod

tRNA Zamecnick, Hoghland

Katalüütiline funktsioon T.Cech 80.aastate algul

Ribosoomi struktuur 2000: T. Steitz, P. Moor (50S subühik Haloarcula marismortui)

V. Ramakrishnan (30S)

A. Yonath, F. Franceshi, F. Schluencen (30S)

H. Noller, J. Cate, M. Yusupov (70S) kõik Thermus thermophilus

Nende töödega selgus lõplikult, et valke sünteesib RNA komponent ribosoomis, mis kinnitab RNA maailma hüpoteesi.

Nukleotiid- lämmastikalus, suhkur, fosfaat

Nukleosiid

Nukleotiidid ja nukleosiidid osalevad paljudes ensümaatilistes reaktsioonides koensüümidena, olles katalüütiliseks komponendiks (NAD, FAD, etc)

Nukleotiidsed antibiootikumid (arabinotsütidiin, kordütsepiin, puromütsiin)

Keemilised sidemed ja valentsnurgad

X-kiirte difraktsioon-analüüs

Tuumamagnetresonants ja Elektron- paramagnetresonants

NMR: prooton-NMR ja stabiilsete isotoopide kasutamine, metalliioonide sidumine

Tuumaresonants võrreldes valkudega vähem informatiivne (G ja U imidasoolse lämmastiku vesinikside, suhkru konformatsioon, Me+ ioonide sidumine etc.)

muud spektroskoopia meetodid: UV ja IR spektroskoopia

mikrokalorimeetria

neutronite hajumine

vesiniksidemed on põhiline stabiliseeriv jõud nukleiinhapete sekundaarstruktuuris

vesiniksideme tüübid:

üldskeem X-H.....Y doonor-aktseptor

C-H.....O

N-H.....O

N-H.....N

(N-H.....S)

O-H.....N

H-sideme pikkus nukleotiidide vahel 2.82-2.95 Å

võrdluseks C⁴-C³ 1.52Å

C^3’-O^3’ 1.47Å

seega vesiniksidemed on vähemstabiilsed

Vesinikside lammastikaluste vahel, vesiniksideme tekkimise ja stabiliseerimise kooperatiivne iseloom vastavalt skeemile lk 137 Saengeri v.k. raamatus

Watson-Crick paarid:

A-T ja G-C paarid ühesuguse geomeetriaga, vahe C^1’ aatomite vahel on mõlemal paaril võrdne (10.85Å )

WC paaridel moodustuvad H-sidemed Py O⁴, N⁴; N³; O² ja Pu N⁶, O⁶; N¹; N² vahel (skeem) antiparalleelne WC paardumine

pööratud WC paar

Hoosteen paar

teised paardumise võimalused (kolme ja enama aluse vahelised paarid)

Aluspaaride stabiilsus:

WC paarid kcal/mol

G-C 16.79

A-T 7.00

A-U 7.21

Hoogsteen

A-U 6.61

A-U (rev) 6.85

------------------------------------

A-A 5.6

U-U 5.42

G-G 16.04

C-C !0.73

A-G 9.40

G-U 7.78

Aluspaaride stabiilsus seega on erinev ja Watson-Crick paarid ei ole kõige stabiilsemad.

Heeliksi moodustumise seisukohalt on kõige olulisem aluspaaride geomeetria, W-C paaridel geomeetria sarnane ja seetõttu on võimalik kooperatiivne heeliksi moodustumine, kui on tekkinud nukleatsiooni tsenter (3 paari)

Poly(A) ja AMP neeldumisspektreid võrreldes selgub, et poly(A) neelab vähem ja tema neeldumismaksimum on 3 nm väiksem. see on seletatav vertikaalse interaktsiooniga, kuna temp. tõustes poly(A) neeldumine suureneb

Paardumist nimetatakse ka horisontaalseks interaktsiooniks lämmastikaluste vahel, kuna stackingut kutsutakse vertikaalseks interaktsiooniks. Stacking põhineb Van Der Waalsi jõududel, diipol-diipol interaktsioonil aluspaaride vahel. Diipol-diipol vastastoimed: orientatsioonilised 1/r³; induktsioonilised 1/r⁶; dispersioonilised 1/r⁶ (Londoni jõud)

Stackingu stabiilsus sõltub aluste omavahelisest orientatsioonist ja on maksimaalne siis kui ühe nukleotiidi laetud grupp asub teise nukleotiidi hüdrofooobse osa kohal, laetud tuumaga alused ei stacku, stacking puriinide vahel on stabiilsem, Py->Pu ja Py-Py on vähemstabiilsed. Oluline on aluspaaride vaheline kaugus, 3.4 Å on harilikult. Kui 3’ suunas on Pu on stacking selle suunaline, järelikult sõltub stacking lisaks nukleotiidsest koostisest ka järjestusest. C->G stack -14.59 kcal/mol kaheahelalises nukleiinhappes

G->C -9.96

Üheahelalises nukleiinhappes tekitab stacking spiraalseid struktuure.

Paardumine Stacking

entalpia entroopia

kooperatiivne aditiivne

sõltub koostisest` sõltub järjestusest ja koostisest

heeliksi parameetrid

P - 360° rotatsioon

P - spiraali samm

n - korduvate elementide arv ühe pöörde kohta

h - kaugus kahe elemendi vahel

t - pöördenurk mööda spiraali kahe järjestikuse elemendi vahel

t=360° /p

P=nh

A,B,C,D, P ja Z vormid DNA’l, tekkimise tingimused ja konformatsioonilised iseärasused

A,B, C vormid järjestusest sõltumatud

D, E, P ja Z vormid on järjestusest sõltuvad

aluste asend heeliksi telje suhtes, sümmeetria, suhkru konformatsioon erinevates vormides ja fostfaatide vaheline kaugus

suur ja väike vagu, aluspaaride asend suures või väikeses vaos

erinevate heeliksi tüüpide võrdlus

Erinevate vormide stabiilsus

DNA looduses (B ja Z vormid)

Superheeliks ja DNA topoloogilised probleemid L_k = L_n + W_r

Superheeliksi tähtsus DNA stabiliseerimisel

DNA bending ja selle sõltuvus järjestusest ning bioloogiline tähtsus

Nukleiinhapped:

DNA struktuur

heeliksi parameetrid:

P - spiraali samm

n - korduvate elementide arv ühe pöörde kohta

h - kaugus kahe elemendi vahel

t - pöördenurk mööda spiraali kahe järjestikuse elemendi vahel

t=360° /p

P=nh

DNA on paljudes eri vormides (tabel 9-1 Saengerist)

sekundaarstruktuuri vorm oleneb tingimustest, põhiline looduslik vorm on B-vorm

heeliksi sümeetria 10₁

RNA on põhiliselt A või A’ vormis (11₁ või 12₁)

RNA-DNA hübriid on A-vormis

Nagu tabelis näha sõltub kristalse DNA struktuur vee konstrentratsioonist ja ioonsetest tingimustest aga põhiliselt siiski DNA nukleotiidsest koostisest ja mõnel juhul ka järjestusest (D, E, Z vormid).

A ja B vormide võrdlus:

Suhkru konform fosfaatide kaugus aluste rotats kaugus

A vorm C_3’ endo 5,9 Å 30-32,7° 2.56-3.29 Å

B vorm C_2’ endo 7 Å 36-45° 3.0-3.37 Å

Erinev arv paare ühe täispöörde kohta tähendab aluspaaride erinevat pöördenurka (tilt vt. joonis), mis omakorda viib erineva stackingu tekkimisele: mida lähemal on aluspaarid üksteisele, seda suurem on stacking. Järelikult A-vorm on stabiilsem kui B vorm, kuna seda stabiliseerib suurem stacking. Teisest küljest on fosfaatide vaheline tõukejõud vastupidise toimega. Ka DNA-RNA hübriid on stabiilsem kui DNA.

Teisest küljest on B-DNA’l ahelate vaheline stacking stabiilsem kui A-vormil

B-DNA on kõige painduvam vorm, kõverdumine ühe täispöörde kohta kuni 19 kraadi

järjestusest sõltuvalt on konformatsiooni vabadus erinev. B-vormis DNA'l võib tekkida üle- ja alapöördumine.

Jooniselt 11-2 ja 11-3 sek str. ja Cantor & Schimmel (displacement)

Suur ja väike vagu B-DNA’l, suur vagu lahusele ja ligandidele kättesaadav (ka interkaleeruvad värvid EtBr näiteks)

A-vormil on suur ja väike vagu sarnasemad, vahe on põhiliselt sügavuses.

A-vormis on suur vagu kättesaadav ainult Me⁺ ioonidele ja solvendile

B-vormis DNA on kõige painduvam konformatsioon, ka suhkru konformatsioonis esineb suuri erinevusi (hiljem bent või kaldunud DNA). Ühe täispöörde peale on võimalik pöördenurk 19° . Seega on looduslik DNA kompromiss stabiilsuse ja painduvuse vahel.

Vasakpoolse vindiga DNA Z-DNA

mudeljärjestus poly(dG-dC) 0,7 M MgCl₂ või 2,5 M NaCl või alkoholi manulusel

paardumine syn-Pu/anti-Py

dC 2’ endo anti

dG 3’ endo syn

WC paarid antiparalleelsed

Intra-ahelaline stack on normaalne

Inter-ahelaline stack dG stackub O4’ ga

Fosfaatide vaheline kaugus on vahelduv 6,2 või 7,6 Å

Z-vormil on ainult väike vagu, suures vaos asuvad alused

Z-vormi stabiliseerivad natiivses DNA’s polüamiinid

dm⁵C, mis esineb sageli eukarüootses DNA’s stabiliseerib Z-vormi

Looduses esineb Z-DNA nii supehelikaalsetes plasmiidides kui kromosoomides (antiZ-DNA antikehad reageerivad polüteensete kromosoomidega)

Z-vorm ei moodusta nukleosoome ega seo histoone

Z-DNA ja B-DNA üleminekul tekivad üheahelalised osad, mida saab spetsiifiliselt määrata bromoatseetaldehüüdi, kloroatseetaldehüüdi, osmium tetroksiidi või hüdroksüülamiiniga reageerimise järgi.

dietüülpürokarbonaat reageerib eelistatult puriinidega (N7) Z-DNA’s

ka fenantroliini derivaadid on spetsiifilised Z-vormile, aga see tuleb hiljem RNA juures

Bent-DNA ehk kõverdunud DNA

esineb promootorite ja enchanserite läheduses sageli UAS’na

Kõverdumine tekib perioodilise kaldumise tulemusena, mis omakorda on põhjustatud ebakorrapärasest stackist (vt. Sinden lk. 64)

DNA kõverdumine põhjustab aberratiivset liikuvust PAAGis (aegalasem liikumine, mida seletatakse DNA painduvuse vähenemisega ja seega geeli võrgustiku halvema läbivusega).

Valgud indutseerivad DNA kõverdumist (AraC seondub kolme kohaga operaatorjärjestuses) vt. Sinden lk. 76

SV40 T antigeeni sidumist soodustab kõverdus, mis on tekitatud kahe 5bp sidumiskoha vahel paikneva A-trackti poolt

l -faagi replikatsiooniks on vajalik O-valgu sidumine, mida stabiliseerib nelja sidumiskoha vaheliste A-tracktide poolt indutseeritud kõverdumised.

rRNA operonide UAS sisaldab fis-valgu sidumiskohti, mida stabiliseerib seal paiknev kõverdus

Tihedalt pakkunud DNA Y DNA

B-DNA biheeliksid on 38 Å vahega.

Etanooliga sadestamisel tekivad saranased struktuurid olenevalt ioonsest jõust.

Kromosoomides on DNA superkoilitult (kuni 10¹⁰ aluspaari)

Bakteri kromosoomis on tuumaks RNA ja aluselised valgud, kromosoomidel perioodiline side membraanidega.

Inimese kromosoomistik 3x10⁹ aluspaari, DNA/histoon 1/1 vahekorras

Nukleosoom on 160-250 bp, millest DNaasiga tekivad 146 bp jupid

nukleosoomid moodustavad supervinte, iga nukleosoom sisaldab 1,75 pööret ja selle südamik on 45 Å

Ahelate seotus Lk või L (parempoolne vint positiivne)

Pööre Tw

Homogeenses kaheahelaises L=T

Supervint L=T+W, ka see võib olla negatiivne kui on vasakpidine.

vt. Sinden lk 102

negatiivse L numbriga Z-DNA’l on DNA topoloogias suur tähtsus, kuna see aitab supevinte tekitada ilma topoisomeraaside abita

Topoisomeraasid ja helikaasid

DNA riststruktuurid (cruciforms)

DNA järjestuse sümmeetria tüübid:

pööratud järjestused e. palindroomid

peegeljärjestused

otsesed kordused

(joon. lk. 135 Sinden)

palindroomsed järjestused võivad tekitada risstruktuure (joon. lk. 142 Sinden)

risti tekkeks on vajalik aktivatsiooni energia, mis tuleb neagtiivsest supekoilist, see on kõik või mitte midagi protsess ja juhul kui näiteks plasmiidi järjestus võimaldab risti teket siis teatud arvu supervintide puhul, tekib rist kõigil molekulidel.

Paljude restriktaaside ja ka muude valkude sidumiskohad on palindroomsed

(dimeersed repressorid)

paljude plasmiidide ja viiruste ori piirkondades esineb palindroome

H-vorm: Hoogsteen + WC paarid

Järjestusest sõltuv: Pu motiiv ja Py motiiv kolmikahela tekkes.

Kolmas ahel stabiliseerib struktuuri, aga 3. ahela seondumine on nõrgem võrreldes W-C paardumisel tekkiva 2-ahelaga.

Kolmikahel on ligandidele halvemini kättesaadav, ei seo järjestuse spetsiifilisi ligande (regulaatorvalgud)

Paardumist mõjutavad keskkonna tegurid: temperatuur, pH, ühe- ja kahevalentsete ioonide kontsentratsioon, H... sidemete konkurents, keskkonna polaarsus (vee kontsentratsioon), NA'ga seonduvad ligandid: polüamiinid, interkaleeruvad ligandid.

Valguse neelamine ja selle sõltuvus olenevalt aluspaaride koostisest, paardumisest ja stackingust. Neeldumisspekter tuleneb osalaengute jaotusest lämmastikaluste tuumades, mida ühtlasem laengute jaotus, seda suurem aromaatsus ja seega neelduvus 260 nm juures. Vesiniksidemete moodustumisel tekib ebaühtlane osalaengute jaotus, mis viib aromaatsuse ja neelduvuse vähenemisele.

Hüpokroomne efekt Hy(%)=100(A_den-A_nat)/A_den on absorbtsiooni (valguse neeldumise) vähenemine nukleiinhappe lämmastikaluste interaktsioonide tulemusena. Näiteks kaksikahelalise struktuuri teke alusppardumise tulemusel, mille juures valguse neeldumine 260 nm juures väheneb 25-30%.

Neeldumisspektri alusel nukleiinhappe omaduste määramine: sulamiskõver näitab nii nukleotiidset koostist kui paardumist. A-T ja G-C paaridel on hüpokroomne efekt erinev 260 ja 280 nm juures, mis võimaldab määrata eri paaride osa nukleiinhappe struktuuris.

Termodünaamilised parameetrid:

Vant'Hoffi seadus

Forfotriester meetod

Fosforamidiit meetod

Üheahelaline RNA seob Me²⁺ ioone Kd=0.1-10 mM, NMP Kd>10 mM

mis näitab, et polünukloetiid seob Me²⁺ ioone spetsiifiliselt, tõenäoliselt kahe järjestikuse fosfaadi vahele. Juba väikestes kontsentratsioonides (< 10 mM) tõstavad Me²⁺ Tm’i.

Struktureeritud RNA’del on nõrgad ja tugevad sidumiskohad, viimased näitavad sidumistaskute olemasolu.

Kõige paremini tuntud tRNA Me²⁺ sidumiskohad (Tabel 3) Erinevatel ioonidel on erinevad sidumiskohad (joonis 2) Tugevad seondumiskohad moodustuvad koordinatiivsete sidemete abil fosfaatide hapnikega (joon. 1)

2’-OH on nukleofiil, mis tekitab 2’-3’ tsüklilise fosfaadi ja 5’OH. Selline mehhanism on iseloomulik aluselisele hüdrolüüsile ja paljudele RNaasidele. Metalliioonid koordineerivad hapniku aatomeid. (joon. 4)

T. R. Cech, 90 Annu. Rev. Biochem, R. H. Symons, ibid. 92, T. R. Cech ..... A. M. Pyle, JBC, 92

valgusüntees: P. Nissen, et al., 2000 Nature 286, 920-930

Ribosüümide poolt katalüüsitavad reaktsioonid:

-RNA fosfodiestersideme hüdrolüüs (in cis ja in trans)

-RNA ligeerimine

-RNA polümerisatsioon

-RNA replikatsioon

-2’3’ tsüklofosfaadi hüdrolüüs

-fosfomonoestersideme reaktsioonid

-karbonüülse süsiniku reaktsioonid

-valgu biosüntees

Spalisingu tüübid (Cech, 90, joon 1)

Grupp I self-spicing, enamuuritud (esimesena) Tetrahymena termophila tuuma rRNA intron (Neurospora ja Saccaraomyces’e mt-mRNA ja rRNA intronid), T4, SP01pre-mRNA jt. Iseloomulik on tsüklilise RNA teke ja G kofaktori lülitumine, mille järgi neid kõige sagedamini otsitakse.

Reaktsioonid (Cech, joon 2) kaks järjestikust transesterifitseerimist. 5’ sait on UpA, mida G atakeerib, see side on iseenesest nõrk. Ligeerumistsentri fosfaat on pärit GpU. Vaheühend sisaldab introni 3’ eksoni küljes, mis on leitud nii in vitro kui in vivo.

GI introni sek ja ters struktuur, konserveerunud tuum ja variaabel väline osa, konserveerunud üksteisest kaugel (prim str.) asuvad osad, mis ei ole intron-ekson piiri lähedal.