7. ÜKSIKAHELALISED DNA JA RNA FAAGID.
8. BAKTERIOFAAGIDEL PÕHINEVAD KLONEERIMISVEKTORID
7. ÜKSIKAHELALISED DNA JA RNA FAAGID.
7.1. Üksikahelalised DNA faagid.
1. Ikosaeedrilised - ŲX174, G4
2. Filamentsed (helikaalsed) - f1, M13
Nende faagide paljunemistsükkel ja genoomi replikatsioonistrateegiad on sarnased. ssDNA faagid ei inhibeeri peremeesraku makromolekulide sünteesi v.a. ikosaeedrilised infektsiooni hilises staadiumis.
Infektsioon.
Enamus filamentseid faage adsorbeerub F-pilide otstele. Infektsioonil on oluline roll pilootvalgul. Faagil ŲX174 paikneb see kapsiidi nurkadest väljaulatuvatel ogadel, M13-l aga filamendi ühes otsas.
Pilootvalgul on mitu funktsiooni:
1.Viiruspartikli adsorptsioon rakupinna retseptoritele.
2. Pärast konformatsioonilisi muutusi viib faagi DNA rakku
3. Initsieerib faagi DNA replikatsiooni, viies faagi DNA kokku raku plasmamembraanil paikneva raku DNA replikatsiooni aparaadiga.
4. Oluline valk faagi morfogeneesil
Faagi geneetilise materjali ökonoomsust näitab seegi, et faagi geenid võivad olla kattuvad. Näiteks faagi ŲX174 geen E (rakkude lüüs) sisaldub geenis D (viiruspartikli assambleerumine). Need 2 geeni paiknevad erinevates lugemisraamides. Geen J, mille produkt on samuti viiruspartikli üks komponente, paikneb geeni D järjestuse kolmandas lugemisraamis.
Kui faagi DNA on sisenenud rakku, inkorporeeritakse kapsiidivalgud raku plasmamembraani, et neid pärast uuesti kasutada.
7.2. Genoomi replikatsioon faagi ŲX174 näitel.
Genoomiks on ssDNA (+) ahel. Infektsioonitsükli erinevatel etappidel on DNA replikatsioonimehhanismid erinevad.
I. (+) ahelalt (-) ahela süntees - tekib replikatiivne vorm RF, mis on kaksikahelaline.
Kuigi faagi genoom on üksikahelaline, on seal ahelasiseseid paardumisi. SSB (Single Strand Binding Protein) on tetrameerne valk, mis seondub kooperatiivselt ssDNA-le, et vältida sekundaarstruktuuride teket. Kogu genoom kaetakse SSB-ga, v. a. üks juuksenõelastruktuur, mis on oluliseks signaaliks replikatsiooni initsiatsioonle. M13-l on see struktuur 59 bp. Raku RNA polümeraas sünteesib 20 - 30 nt pikkuse praimeri. Süntees algab 6 nt enne sekundaarstruktuuri ja lõhub selle. Seejärel seondub SSB vabanenud ssDNA-le ja termineerib edasise transkriptsiooni. Jätkub DNA replikatsioon RNA praimerilt. Kasutades matriitsina (+) DNA ahelat, sünteesib DNA polümeraas III komplementaarse ahela, kuni jõuab tagasi RNA praimerini. DNA polümeraasil on ka eksonukleaasne aktiivsus, ta kõrvaldab RNA praimeri ning seejärel sünteesib täis tühiku. DNA ahela otsad liidetakse kokku ligaasi abil.
Faagi G4 puhul ei sünteesi praimerit mitte RNA polümeraas vaid dnaG geeni produkt praimaas (ingl. k. primase).
ŲX174 genoomi puhul on replikatsiooni initsiatsiooni protsess keerulisem. Juuksenõelastruktuuri juures moodustub 6-st valgust koosnev prepraiming kompleks. dnaG produkt sünteesib praimereid DNA molekuli erinevatesse kohtadesse. Seejärel liigub prepraiming kompleks sinna, kuhu on sünteesitud praimer.
II. RF-i paljundamine. RF on substraadiks raku RNA polümeraasile. Nüüd saab toimuda ka faagi geenide transkriptsioon. Kui rakus on kogunenud geeni A produkti gpA (faagispetsiifiline endonukleaas), toimub RF-i replikatsioon veereva ratta mudeli järgi, paljundatakse mõlemat DNA ahelat. gpA teeb spetsiifilise katke (+) ahelasse ja jäädes seotuks 5’ otsale, liigub kaasa replikatsioonikompleksiga. Kui süntees algsesse punkti tagasi jõuab, lõikab ta jälle spetsiifilist järjestust ning algab uue ringi süntees. Samas käitub ta ka kui ligaas, viies kokku sünteesitud molekuli otsad. Matriitsiks on (-) ahel. (+) ahelalt toimub süntees Okazaki fragmentidega.
RF-i molekule sünteesitakse faagi f1 korral 100 - 200 koopiat, ŲX174 puhul 10 - 20 koopiat.
III. (+) ahela süntees RF-i (-) ahelalt faagi genoomi paljundamiseks. (+) ahelalt on replikatsioon blokeeritud spetsiifiliste valkude (pakkimisvalgud) seostumise tõttu selle ahelaga.
Morfogenees.
ŲX174 puhul toimuvad viiruse assambleerumine ja DNA süntees samaaegselt. Viiruspartiklid vabanevad raku lüüsil. Filamentsete faagide puhul seondub DNA esmalt faagi-spetsiifilise DNA-d siduva valguga ja kompleks liigub raku sisemembraanile, mis sisaldab vanu ja uuesti sünteesitud kapsiidi valke. Rakk ei hävine viiruse paljunemisel.
7.3. ssRNA-d sisaldavad faagid.
Väikesed ikosaeedrilised faagid, mis tunnevad ära F-pilisid ja kasutavad neid kui kanaleid
RNA rakku viimiseks. Genoomiks on (+) RNA ahel, mis käitub ka mRNA-na.
RNA järjestuste ja seroloogiliste katsete põhjal jaotatakse 2 gruppi:
1. f2, MS2, R17
2. Qß
Geneetiliselt on nad väga lihtsad. MS2 genoom (3569 nt) on esimene viiruse genoom, mille nt järjestus sai määratud.
Geenid on kattuvad:
1. Kapsiidi valk (domineeriv)
2. RNA replikaasi subühik
3. Maturatsiooni valk, oma funktsioonidelt sarnane ssDNA faagide pilootvalgule
4. Lüüsi valk
Replikatsiooni viib läbi RNA replikaas:
1. (+) ahelalt (-) ahela süntees - RF
2. Genoomi (+) ahela paljundamine
RNA replikaas on väga spetsiifiline ensüüm, mis tunneb ära ainult samasse gruppi kuuluvate faagide RNA. Äratundmiseks on oluline CCC järjestuste kindel asukoht RNA molekulis. Qß viiruse replikaasil on 4 subühikut, milledest ainult üks on faagi poolt kodeeritud.
a - 65,5 kDa, faagi RNA poolt kodeeritud
b - 61,2 kDa, ribosoomi valk S1
c - 43,2 kDa, EF-Tu
š- 30,3 kDa, EF-Ts
Erinevate RNA ahelate replikatsiooni läbi viivate ensüümide koostis on erinev.
Alguses toimub (+) ahelalt (-) ahela süntees - seda teostab holoensüüm + rakuline faktor. Moodustub replikatiivne vorm RF. Seejärel toimub sünteesitud (-) ahelalt (+) ahela süntees - seda teostab apoensüüm (puudub a subühik). Bakteri poolt kodeeritud faktorite roll faagi replikatsioonil erineb nende rollist valgusünteesil, valgusünteesil mitte funktsioneeruvad faktorid võivad endiselt osaleda replikatsioonil. Peremeesraku faktorid muudavad a -subühiku konformatsiooni ning RNA 3-mõõtmelist struktuuri. Sünteesitud ahela 3’ otsa viiakse adenüülhappe jääk nagu tRNA-del.
Viirusvalkude translatsiooni regulatsioon.
Valke sünteesitakse erinevates kogustes:
1. Replikaasi subühikut transleeritakse infektsiooni varajases faasis i-faktori juuresolekul,hiljem toimub tagasiregulatsioon.
2. Selleks, et vältida samaaegselt toimuvat RNA replikatsiooni ja translatsiooni (+) ahelalt, inhibeerib replikaas ribosoomi seondumise (+) RNA-le seniks, kuni pole piisavalt (-) RNAd.
3. A valgu RBS on normaalselt RNA sekundaarstruktuuri tõttu blokeeritud, translatsioonon võimalik ainult samaaegselet ahela replikatsiooniga.
4. Kapsiidi valk on domineeriv, ta on ka replikaasi translatsiooni repressoriks.
Replikaas teeb RNA sünteesi käigus palju vigu, vigade tekkesagedus on tunduvalt suurem kui RNA polümeraasi puhul. 4220 nt suuruse Qß genoomi mutatsioonisagedus nukleotiidi kohta ühes generatsioonis on 3 x 10-4. Seetõttu on RNA faagide populatsioon heterogeenne.
8. BAKTERIOFAAGIDEL PÕHINEVAD KLONEERIMISVEKTORID.
Võimaldavad isoleerida ja paljundada spetsiifilist DNA fragmenti genoomist ja uurida seal sisalduvat geneetilist informatsiooni.
DNA primaarjärjestuse määramine
geeni(de) avaldumise regulatsioon
geeniproduktide funktsioonide uurimine
geenitehnoloogia
Väga paljude kloneerimisvektorite konstrueerimisel on kasutatud bakteriofaage. Tinglikult jaotataksegi kloneerimisvektorid faagidel põhinevateks vektoriteks ja plasmiidseteks.
8.1. Plasmiidsed vektorid.
Võimaldavad kloneerida väikeseid DNA fragmente.
1. Üldise funktsiooniga vektorid
a) insertsiooniline inaktivatsioon - sel juhul on kloneerimissaidid viidud vektoris olevasse geeni, mille avaldumist on lihtne testida (näiteks ravimiresistentsusgeenid - pBR322 tet geeni inaktivatsioon; lacZ).
b) positiivse selektsiooniga - fragmendi inserteerimine vektorisse derepresseerib seal teatud geneetilise markeri. Näit. vektoris pUN121 on kloneerimissaidid viidud tet repressorisse.
2. Ekspressioonivektorid.
Insereerunud DNA-s sisalduvaid geene transkribeeritakse vektoris oleva promootori alt. Näit. pUC18 & pUC19.
3. Promootorite või transkriptsiooni terminaatorjärjestuste testimine.
Võimaldavad isoleerida DNA fragmente, mis sisaldavad promootorit või transkripsiooni terminaatorit ning jälgitakse vastavalt kas testgeeni transkriptsiooni aktivatsiooni või terminatsiooni.
8.2. Kosmiidid.
4 - 6 kb suurused plasmiidid, mis sisaldavad faag lambda cos järjestusi. Lisaks sellele sisaldavad nad ravimi resistentsusgeeni plasmiidiga bakterirakkude selektsiooniks, järjestusi plasmiidi replikatsiooniks ja unikaalseid restriktsioonisaite kloneerimiseks.
Võimaldavad kloneerida suuri, ~45 kb pikkusi DNA fragmente. Rekombinantse DNA molekulid pakitakse in vitro faagi kapsiidi. Kuna pakkimisel on olulised ainult cos saidid ja DNA molekuli pikkus, pakitakse ainult rekombinantsed DNA molekulid kindla insertsiooni pikkusega. Nakatatud rakkudes replitseerub vektor nagu plasmiid, selektsiooniks on ravimi resistentsusgeeni avaldumine.
8.3. Fagemiidid.
Sisaldavad plasmiidi replikatsiooni järjestusi, selektsioonimarkerit ning filamentse faagi genoomi. DNA fragmente kloneeritakse sellesse vektorisse ja rekombinantset DNA-d paljundatakse nagu plasmiidide puhul. Rakkude nakatamisel sobiva helperfaagiga toimub ümberlülitumine plasmiidi replikatsioonilt üksikahelalise DNA replikatsioonile. Fagemiidide puhul on võimalik eraldada nii dsDNA-d kui ka DNA-d. ssDNA-d eraldatakse faagipartiklitest:
DNA järjestuse määramine
koht-suunatud mutagenees
ahela-spetsiifiliste DNA proovide valmistamine nukleiinhapete hübridisatsiooniks
8.4. Vektorid bakteriofaagide DNA-st.
Kasutataks nii ssDNA kui ka dsDNA faagide genoomi.
1. ssDNA faagid (filamentsed) f1, M13.
Filamentsed faagid nakatavad rakke F-pilide kaudu. Seetõttu peavad nakatatavad rakud olema "isased", s. t. sisaldama F-plasmiidi.
Näit. vektorid M13mp18, M13mp19 sisaldavad sama kloneerimisregiooni nagu pUC19 ja pUC18. Selektsioon toimub värvusreaktsiooni järgi. Vektoris on lacZ geen, mis kodeerib b -galaktosidaasi. IPTG (isopropüül-b -tiogalaktopüranosiid) indutseerib lacZ geeni avaldumise. Ensüüm on võimeline lagundama substraati x-gal (5-bromo-4-kloro-3-indolüül-b -galaktosiid), tekib sinist värvi produkt bromokloroindool. Algselt on lacZ geeni algusossa konstrueeritud kloneerimissaidid nii, et nad ei inaktiveeri b -galaktosidaasi. Kui kloneerimissaitidesse inserteerida võõrast DNA-d, inaktiveerub lacZ geen ja värvusreaktsiooni ei teki. Faagipartiklisse pakitakse alati (+) ahel. Sõltuvalt fragmendi orientatsioonist vektori replikatsiooni alguspunkti suhtes on võimalik valikuliselt ssDNA-na amplifitseerida ühte kloneeritud DNA ahelatest.
ssDNA isoleeritakse faagipartiklitest, dsDNA (RF) isoleerimine toimub aga rakkudest.
2. dsDNA faagid.
Enamus kloneerimisvektoreid on konstrueeritud faag lambda DNA põhjal. Võimaldavad kloneerida suuri DNA fragmente. Välja on töötatud süsteemid, mis takistavad mitterekombinantide paljunemist. Erinevad rekombinantsed molekulid katavad kogu genoomi. Rekombinantsete molekulide panka nimetatakse ka raamatukoguks. Rekombinantseid DNA molekule sisaldavaid faagipartikleid sisaldavat lüsaati säilitatakse 4 C juures 0,3% kloroformi juuresolekul.
a) Asendusvektorid (näit. l gt-l l) - ainult 2 EcoRI saiti äratuntavad. Võimaldab deleteerida infektsiooniks mittevajaliku segmendi l genoomist, alles jääb 72% genoomist. Kuna lambda pakkimisel pole oluline, milline on DNA järjestus cos saitide vahel, vaid hoopis DNA molekuli pikkus, saab sõltuvalt vektorist inserteerida kuni 24 kb võõrast DNA-d.
b) Insertsioonivektorid - väiksemate DNA fragmentide kloneerimiseks, rekombinandid tuvastatakse faagi teatud bioloogilise funktsiooni kadumise järgi. Näiteks on kloneerimissait konstrueeritud cI geeni (inaktiveerib lambda repressori - selged lüüsilaigud. Kui lambda repressor on funktsionaalne, on lüüsilaigud hägused). Teine võimalus on kasutada lacZ geeni inaktivatsioonil põhinevat testsüsteemi.
Vektorid, millede abil on võimalik kontrollida lüütilist ja lüsogeenset tsüklit.
* lambda repressori temperatuuri tundlikud mutandid
* hflA mutandid - eelistatult lüsogeenne tee. hflA geeni produkt surub alla cII avaldumist. cII on valk, mis on vajalik lambda repressori cIgeeni transkriptsiooniks.
Lambda repressori temperatuuritundlike mutantide korral saab faagi lüütilisse tsüklisse minekut indutseerida keskkonna temperatuuri tõstmisega 42 C juurde. Kui faag on defektne rakkude lüüsi suhtes, on võimalik amplifitseerida vektoris sisalduvate geenide produkte.
In vitro pakkimine.
Rekombinantse DNA pakkimine faagipartikliteks, kasutades defektseid faaage, mis produtseerivad valkkatteks vajalikke komponente, kuid pole ise võimelised paljunema.
1. Kahe pakkimismutandi kasutamine (mutantide ekstraktid segatakse hiljem kokku). Et välistada faagi genoomi pakkimist, kiiritatakse ekstrakte enne kasutamist UV-ga.
2. Ühe mutantse faagi kasutamine. Profaag sisaldab deletsioone cos regioonist. Kui toimub
profaagi induktsioon ja pakkimisvalkude tootmine, ei pakita faagi DNA-d, kuna sellel puuduvad vastavad signaalid pakkimiseks.