RETROVIIRUSED

Retroviiruste elutsükkel kulgeb DNA vahevormi kaudu. Virioonides olevast RNAst sünteesitakse kaheahelaline DNA, mis lülitub raku genoomi ja juhib sealt aeglast virioonide tootmist. Enamus neist on kitsa liigispetsiifikaga, nakatades vaid ühte või kahte liiki.

Retroviiruste klassifikatsioon on viimasel ajal muutunud seoses nende genoomi järjestuse täieliku määramisega. Praegu jaotatakse nad perekondadesse vastavalt pöördtranskriptaasi järjestuse konserveerumisele. Lisaks nukleiiinhappe järjestustele arvestatakse grupeerimisel ka viriooni kuju elektronmikroskoobis ja regulaatorvalkude olemasolu genoomis. Järgnevas tabelis on toodud praegune arusaam retroviiruste süstemaatikast.

Perekond	Esindajad (viiruste nimed)	Märkused
Lindude leukoos või sarkoom	Rous Sarcoma, Avian Myeloblastosis, Avian Erythroblastosis, Rous-associated virus 0-50	sisaldavad rakulisi onkogeene. RAV-0 on endogeenne
Imetajate retroviirused, C-tüüp	Moloney Murine Leukemia, Harvey Murine Sarcoma, Abelson murine leukemia, Feline Leukemia, Simian Sarcoma, Retikuloendotheliosis	mõned sisaldavad rakulisi onkogeene, põhjustavad T rakkude lümfoome, immuun-puudulikkust ja teisi haigusi.
Imetajate retroviirused, B-tüüp	Mouse Mammary Tumor (MMTV)	nii endo- kui eksogeensed, levivad piimaga, põhjustavad rinnakartsinoomi ja T-lümfoome, esineb sag geen.
Imetajate retroviirused, D-tüüp	Mason-Pfizer Monkey, Simian Aquired Immunodeficiency	SAIDS ahvidel
HTLV-BLV	HTLV-I, HTLV-II, Bovine Leukemia	T- või B rakuline lümfoom. Genoomis tax ja rex
Lentiviirused	HIV1, HIV2, SIV, FIV, BIV, Visna virus	erinevad immuunpuudulikkuse viirused, mitte väga sarnased. Palju väikseid regulaatorgeene.
Spumaviirused	Human Foamy Virus, Simian Foamy Virus, Feline Syncytium forming virus	healoomulised vahuviirused, sidet haigustega pole leitud.

1.Virioon. Lipiidkestaga, 100 nm läbimõõdus. Kardab kuivamist ja kuumutamist 60C >30 min. Välismembraanis kaks valku (SU ja TM), sisemine kapsiid moodustub vähemalt kolmest struktuurvalgust: kapsiidivalk (CA), maatriksvalk (MA), RNA pakkimiseks kasutatav nukleokapsiidi valk (NC). Mittestruktuursetest valkudest võib viriooni sees leida viiruse proteaasi (PR), integraasi (IN) ja pöördtranskriptaasi (RT) molekule. Mõnedel perekondadel esineb ka deoksüuridiintrifosfataas (DU), mis väldib dUTP lülitumise viiruse DNAsse kui see tsütoplasmas sünteesitakse. Viriooni sees võib esineda ka raku pinnavalke, mis sinna pakkimisel juhuslikult võivad sattuda.

Joonis 1531. Retroviiruse viriooni väga üldistatud skeem.

2.Genoom. Viriooni sees paikneb üheahelaline plusskodeeringuga RNA kahe identse molekuli näol. Genoomi pikkus varieerub 7000-10000 nukleotiidini. DNA kujul genoomi integreerunult nimetatakse seda viirust proviiruseks. Viriooni sees on genoomil mRNA struktuur (cap + polyA), kuid rakku sisenedes ei funktsioneeri ta mRNAna. Genoomis võib kõikidel retroviirustel leida kolm suurt geeni gag, pol, env. Peale nende võib mõne perekonna viirustel olla väiksemaid regulaatorvalke kodeerivaid geene.

Joonis 1445. Genoomi struktuur erinevatel retroviiruste perekondadel ja tüüpidel. Noolekesed näitavad translatsiooni alguspunkte.

Otstes on retroviirustel kordusjärjestus R. Proviiruse genoomi otstes on pikemad kordusjärjestused (LTR), mis on tekkinud tänu omapärasele replikatsiooni mehhanismile. Peamised regulatoorsed järjestused genoomis on järgmised:

U3 - sisaldab promootorit ja enhansereid,
R - otsmine kordusjärjestus,
U5 -
PB - primer binding, seob rakulise tRNA, mis on esimese DNA ahela sünteesil praimeriks.
L - liiderjärjestus enne gag geeni algust, sisaldab splaisingu doonorsignaali ja genoomi pakkimissignaali.
PP - genoomi tagumises otsas paiknev polüpuriinide rida, mis on hädavajalik viiruse korrektseks replikatsiooniks.

Peale gag-pro-pol-env geenide esinevad väiksemad geenid:
MMTV - orf ehk sag
HTLV - tax, rex
HIV - tat, rev, nef, vif, vpu, vpr, vpx
HSRV - bel1 ( funktsioonilt analoogne tax valgule), bel2, bel3, bet.

3.Elutsükkel. Nakatumine algab viiruse kinnitumisega rakulisele retseptorile. Retseptoreid, millele retroviirused võivad kinnituda, on identifitseeritud mitmeid. Nende hulgas on raku retseptorid nagu CD4, basaalsed aminohapete transportvalgud, fosfaatioonide transportkanalid jms. Ilmselt ei vali retroviirused retseptoreid nende funktsiooni järgi. Peale nakatamist on nakatunud rakkudele iseloomulik nn. interferentsi nähtus. Nakatunud rakk ei saa enam sama viirusega nakatuda, kuna viirus organiseerib retseptorite eemaldamise raku pinnalt või nende muutmise viirustega mitteseonduvateks (analoogne gripiviiruste hemaglutiniin-neuraminidaas süsteemile). Retseptorite kõrvaldamise või inaktiveerimise eest hoolitseb env valk, seostudes juba Golgi kompleksis retseptoriga. HIVi puhul osalevad samas protsessis veel lisaks nef ja vpu. Rakku jõudmine toimub enamusel retroviirustel tüüpiliselt läbi endosoomide, HIVil aga otseselt läbi raku pinnamembraani.
DNA süntees. Lihtne genoomi kopeerimine pole võimalik, kuna DNA sünteesiks vaja praimerit ja probleemid tekivad praimeri aluse ala täitmisel. Okazaki fragmentide tüüpi süntees pole ilmselt viirusele jõukohane, viiruse ainukeseks valguks mis replikatsioonil osaleb on pöördtranskriptaas. Seega replikatsiooni mehhanism keerukas, replikatsioonikompleks peab tegema kaks hüpet, et replikatsiooni täielikult lõpetada. DNA mõlemad ahelad tehaksegi valmis tsütoplasmas kapsiidi sees. Kahest genoomsest RNA molekulist tehakse tavaliselt lõppkokkuvõttes üks proviirus, teise kopeerimiseks ei jätku ilmselt ressursse. Primer tRNAks on HIV viirusel tRNA^Lys, teised retroviirused kasutavad ka tRNA^Pro või tRNA^Trp molekule. Replikatsioonikompleksi hüppamine toimub edukalt ainult kapsiidi sees, in vitro on see protsess väga ebaefektiivne, ilmselt omavad kapsiidivalgud seejuures organiseerivat rolli.

Joonis 1792. Retroviiruse genoomi replikatsioon. Peenike joon tähistab RNAd, keskmine miinusahelalist DNAd ja jäme joon plussahelalist DNAd. Algne RNA ahel süüakse ära pöördtranskriptaasiga kaasneva RNaasH domääni poolt. Esimese DNA ahela sünteesil on praimeriks rakuline tRNA, teise puhul genoomse RNA jupp polüpuriinide piirkonnast, mis jääb RNaasH poolt söömata.

Kapsiidist vabaneb vastselt sünteesitud DNA tuuma, kus toimub tema integreerumine raku genoomi. Integreerumine on aktiivne ja spetsiifiline protsess, mis on katalüüsitud viiruse integraasi poolt. Mõned retroviirused vajavad integreerumiseks jagunevaid rakke, lentiviirustel pole see obligatoorne. Integreerumise kõrvalproduktideks on ühe või kahe LTRiga viiruse rõngasmolekulid. Viiruse genoomi otsast kaob integreerumise käigus kaks nukleotiidi, raku DNAs duplitseerub 4-6 nukleotiidi, olenevalt viirusest. Integreerunud proviiruse otstesse jääb alati TG...CA. Raku seisukohalt on integreerumine mittespetsiifiline see tähendab toimub juhuslikku piirkonda genoomis. Peale integreerumist käitub proviirus kui Mendeli seaduste järgi pärinev raku geen. Integreerumine on peaaegu pöördumatu, proviiruse väljumine genoomist toimub sagedusega 10^-7 generatsiooni kohta.

Transkriptsioon. Viiakse läbi rakulise RNA polümeraas II poolt vastavalt signaalidele, mis proviiruse LTRis kodeeritud. See sisaldab lisaks promootorile ka koespetsiifilist enhanser'it. Teatud rakkude diferentseerumisaste on seega oluline viiruse nakkuse tekkeks. Promootori aktiivsust mõjutab tunduvalt ka koht kuhu ta on genoomis integreerunud. Naabruses asuvad järjestused võivad võimendada või ka pidurdada viiruse geenide ekspressiooniSünteesitud mRNAd läbivad suuremas või väiksemas ulatuses splaisingu. Teatud osa toodetakse ka splaisimata mRNAsid, millest osa talitleb genoomse RNAna ja pakitakse kapsiididesse. Peale rakuliste transkriptsioonifaktorite võivad viiruse geeniekspressiooni mõjutada ka viiruse enda valgud. HTLV tax on võimeline aktiveerima kaudselt rakulisi transkriptsioonifaktoreid (nagu NFB) ja selle kaudu ka viiruse või raku geene. HIVi tat valk töötab mõnevõrra teise põhimõttega. Ta on võimeline seostuma viiruse mRNA alguses oleva tar-elemendiga, suurendades sellega RNA polümeraasi protsessiivsust antud piirkonna läbimisel ja ka initsiatsiooni LTRis asuvalt promootorilt. Heteroloogseid promootoreid võib tat aktiveerida või supresseerida sõltuvalt kontekstist. Vastavate viiruste rex ja rev valgud töötavad ilmselt sarnase põhimõttega. Mõlemad on võimelised seostuma env geeni intronis oleva struktuuriga täispika mRNA peal. Selline seostumine väikeses kontsentratsioonis inhibeerib, suuremas kontsentratsioonis stimuleerib nende täispikkade mRNAde jõudmist tsütoplasmasse. Ilma sellise regulatsioonimehhanismita ei jõuaks osaliselt splaisitud või splaisimata mRNAd peaaegu üldse tuumast välja. Seega rev ja tat tagavad, et viiruse nakkuse algfaasis tehtaks piisavalt väiksemaid regulaatorvalke, mis tulevad tugevasti splaisitud mRNA pealt ja alles seejärel suuremaid struktuurvalke (nagu gag-pol-env).

Translatsioon. Regulaatorgeenide ja env geeni translatsioon toimub tavalise mehhanismi järgi monotsistroonselt mRNAlt. Täispika mRNA pealt aga transleeritakse kahte kuni kolme erinevas lugemisraamis olevat geeni. Need on gag-pro-pol. Selleks kasutab viirus spetsiaalseid järjestusi, mis soodustavad ribosoomide libisemist kahe geeni piiril ja sellega -1 raaminihet. Raaminihke tõenäosus on enamuse retroviiruste puhul 5%, seega 1/20 selle mRNA pealt sünteesitavatest valkudest on pikad liitvalgud, mis sisaldavad kõigi kolme valgu järjestusi. Spumaviirustel ja endogeensetel retroelementidel LINE esineb analoogses situatsioonis +1 raaminihe. Selline mehhanism on viiruse kohastumus tootmaks kapsiidivalke gag geenist ja pöördtranskriptaasi pol geenist õiges omavahelise suhtes. On leitud, et kui lasta viirusel toota ainult liitvalku, ei suuda viirus neid viriooni sisse ära mahutada. Env valk sünteesitakse endoplasmaatilise retiikulumi pinnal ja läbib, nagu kõik raku välispinna valgud ulatusliku protsessingu Golgi kompleksis. Tema lõikamine kaheks subühikuks, TM ja SU toimub Golgi kompleksi sees rakuliste proteaaside poolt. Mõlemad subühikud jäävad teineteisega seotuks.
Viiruse pakkimine. Viriooni pakkimine toimub raku välismembraanil kuhu koonduvad env valgud ja kuhu liiguvad tsütoplasmast ka gag, gag-pro-pol liitvalk ning genoomne RNA. Virioon pakitaksegi esimeses staadiumis kokku sellistest liitvalkudest. Viriooni valmides, kui liitvalgu koostises oleva proteaasi kontsentratsioon on tõusnud piisavaks, et ta saaks võtta dimeerse vormi toimub tema aktiveerumine. Proteaasi aktiveerumise tagajärjel vabaneb liitvalgu koostisest kõigepealt proteaas, seejärel kõik kapsiidi komponendid: CA, MA, NC, RT, IN. Sellist protsessi nimetatakse viiruse küpsemiseks ja sellega kaasnevad muutused on nähtavad ka elektronmikroskoobis (viriooni keskmine osa tiheneb). Viriooni pakkimine on seega kõrgelt organiseeritud protsess, mida pole võimalik korrata üksikkomponentide kokkusegamisega. Mutatsioonanalüüsiga on kindlaks tehtud, et env valgud raku pinnal pole viiruse eluks hädavajalikud, ilma pinnavalkudeta virioonid on ka nakkusvõimelised kui neid kunstlikult rakkudesse viia. Viriooni pakkitakse ka rakuline tRNA, mis hiljem kasutatakse praimerina. Selle tagab tRNA seostumine RTga.

4.Retroviiruste mõju peremeesrakkudele. Retroviiruste arengustrateegia on proviiruse pikaajaline püsimine peremeesrakus ja sellega kaasnev virioonide tootmine. Seetõttu püüavad need viirused rakke mitte kahjustada. Siiski täheldatakse mitmete viiruste puhul erinevat toimet peremeesrakule või -organismile.
Kasvajate tekitamine lühikese peiteaja jooksul. Mõned retroviirused on võimelised tekitama lühikese aja jooksul peale nakatamist peremeesorganismis kasajaid. Kunagi klassifitseeriti sellised viirused omaette perekonda Oncovirus. Tõenäoliselt on need viirused lihtsalt kogemata oma env geeni või mõne teise piirkonna asemele raku genoomist haaranud mõne rakulise regulaatorvalgu geeni, mis viiruse kontekstis võib viia peremeesraku kontrollimatu paljunemiseni. Enamus onkoviirusi põhjustab vererakkude ülemäärast jagunemist, kuid on ka viirusi, mis tekitavad sarkoome või teisi kasvajaid. Praeguseks on leitud, et sellised viirused on siiski ainult viiruste evolutsiooni umbtee ja ükski neist (erandiks on ainult Rous'i Sarkoomi Viirus, RSV) pole võimeline normaalselt paljunema ja teisi rakke nakatama.
Proviiruse insertsiooni poolt tekitatud muutused. Kuna retroviirused integreeruvad raku genoomi, on nakatumine alati seotud riskiga, et integreerumiskoht genoomis saab viga. Põhimõtteliselt võib sellega kaasneda otseselt integreerumiskohas oleva geeni inaktiveerimine või muutmine, aga ka naabruses olevate geenide mõjutamine. Selliseid juhtumeid on piisavalt kirjeldatud kui potentsiaalseid kasvajate või muude geenidefektide põhjustajaid.
Viriooni pinnavalkude mõju raku pinnavalkudele. Friend Murine Leukemia Viiruse puhul on teada, et tema pinnavalk annab oma retseptoriga - erütropoetiini retseptoriga - seostudes viimasele aktiveeritud oleku. Rakku jõuab retseptorilt signaal nagu oleks tema loomulik ligand (erütropoetiin) retseptoriga seostunud. See põhjustab nakatunud rakkude jagunemise.

Inimese T-rakulise leukeemia viirus. HTLV genoomis kodeeritud valk tax omab mittespetsiifilist ja kaudselt aktiveerivat toimet paljudele raku geenidele. Selline tegevus võib aja jooksul (30-40 aasta möödudes) viia leukeemia tekkele. Ainult tax geeni ekspressioonist leukeemia tekkeks ei piisa.

Superantigeenid. On leitud, et Hiire piimanäärme kasvaja viirus (MMTV) kodeerib ühe regulaatorvalguna superantigeeni. Seda nimetati varem orf, praegu sag-geeniks. Superantigeen aktiveerib T-lümfotsüüte suhteliselt mittespetsiifiliselt (5% kogu T-rakkude populatsioonist) ja antigeeni juuresolekust sõltumata. Viirusele on see vajalik B-lümfotsüütide kaudseks aktivatsiooniks kuna ta ise paljuneb B-lümfotsüütides ja rändab nendega piimanäärme kudedesse, kus nakatab epiteelirakke.
Tsütopaatia. Lentiviiruste ja teiste immuunpuudulikkust tekitatavate viiruste puhul esineb teatud tõenäosusega viiruste muutumine tsütopaatiliseks. Sellega kaasneb peremeesraku või mõnede teiste rakkude hävimine. Arvatavasti tulenevad sellised juhtumid mõnest mutatsioonist lentiviiruste poolt kodeeritud negatiivse regulatsiooni faktorites. Tsütopatoloogia mehhanism on erinevatel viirustel erinev ja ebaselge. Osadel juhtudel on see seotud teatud piirkondadega env geeni produktides, osadel juhtudel viiruse võimega paljuneda ekstrakromosomaalse DNAna (FeLV), osadel juhtudel deletsiooniga gag-pol geenis (MAIDS).

5.Endogeensed retroviirused. Imetajate genoomist moodustavad 10% retroelemendid, 1% endogeensed retroviirused. Need on piirkonnad, mis ühel või teisel moel on seotud pöördtranskriptaasse aktiivsusega rakkudes. Nad on kunagi tekkinud retroviiruse integratsioonil sugurakkudesse. Enamus nendest elementidest on täiesti või osaliselt inaktiivsed, s.t. ei ekspresseeri osasid või kõiki geene. Retroelementidel on pühendatud omaette peatükk, endogeenseid retroviirusi tahaks käsitleda koos teiste retroviirustega. Tegelikult selget piiri eri tüüpi retroelementide ja viiruste vahel pole võimalik tõmmata, retroviiruste degenereerumine retroelementideks on pidev ja mitme vaheetapiga protsess.
Eristatakse ürgseid endogeenseid viirusi ja moodsaid endogeenseid viirusi. Ürgsed on olemas kõikide selgroogsete genoomis, moodsad võivad varieeruda sama liigi erinevatel isenditel. Moodsate endogeensete retroviiruste hulgas leitakse ka aktiivseid, virioone tootvaid viirusi. Inimeste genoomis selliseid aktiivseid viirusi pole teada, küll aga näiteks pärdikutel ja erit palju hiirtel. Mõned endogeensetest viirustest on võimelised tootma ainult kapsiide, mis rakust ei välju ja jäävad tsütoplasmasse. Hiirtel nimetatakse selliseid viirusi IAP (intracisternal A particles), sest nad kogunevad raku organellide (Golgi kompleksi) sisse. Hiirtel hinnatakse uue endogeense viiruse tekke tõenäosust 1/3500 generatsiooni kohta. Paljud endogeensed viirused on intaktsed, kuid ei ekspresseeru kuna on raku poolt metüleeritud ja inaktiivses genoomi osas. Vanemate endogeensete viiruste puhul täheldatakse ka ksenotroopsuse efekti - nad on intaktsed, kuid antud liigi rakkudel pole enam selliseid retseptoreid, mis võimaldaksid viirustel levida teistesse rakkudesse. Endogeenseid viirusi loetakse kuuluvat "selfish DNA" hulka, sest nad üldjuhul rakkudele mingit kasu ei too. Ainuke arvestatav efekt peremeesrakkude jaoks on interferents uute retroviiruste suhtes.

6.Esindajad.
HIV. Inimese immuunpuudulikkuse viirus ehk AIDSi tekitaja. Nakatab inimesi ja mõningaid ahve, ahvidel nakkusega immuunpuudulikkust ei kaasne. Esmane nakkus levib veres ja lümfiteedes monotsüütides ja T-lümfotsüütides. Esmane nakkus tõrjutakse tavaliselt keha immuunsüsteemi poolt, misjärel viirus jääb persistentseks lümfisõlmedes. Persistentsuse ajal on immuunsüsteem ja viiruse paljunemine tasakaalus. Teatud aja möödudes (50% 10 aasta jooksul) tekib tavaliselt AIDS. AIDSi on sageli põhjustatud võõraste antigeenide kohtamisest või nakatumisest teiste viirustega. Aktiveerumise ja peremeesrakkude kahjustumise molekulaarsed põhjused pole päris selged. Oma osa selles on viiruse muutlikkusel ja tänu sellele pääsemisel organismi immuunsüsteemi kontrolli alt. Nakatunud peremeesrakkude suremise kõige tõenäolisemaks põhjuseks on viiruse poolt indutseeritud apoptoos. Peale lümfotsüütide ja vereloomerakkude võib HIV kahjustada ka närvisüsteemi rakke. Seejuures on tõenäolisem kaudne toime neuronitele (lümfokiinide toksiline efekt või muu põhjus). AIDSi haigestunute keskmine elulemus on alla kahe aasta. Tüüpilised haigusnähud akuutses staadiumis on pärmide nakkus suu ümbruses, Kaposi sarkoom nahal ja limaskestadel, muude viirusnakkuste ägenemine ja haruldaste bakterioloogiliste haiguste teke. Kõik need nähtused on tingitud T-lümfotsüütide arvu vähenemisest organismis.

HIV levib kõikvõimalikel kokkupuudetel verega või verest valmistatud produktidega. Pole leitud, et viirus oleks levinud süljega, uriiniga, mitteseksuaalse kontaktiga või putukate vahendusel.

Joonis 1553. AIDSi haigestunu Kaposi sarkoomiga.

Teised lentiviirused. Peale HIVi esineb analoogseid aeglase kuluga viirusi ka teistel loomaliikidel. Nad tekitavad sarnast immuundefitsiitsust (ahvide SIV, kasside FIV, lehmade BIV), aneemiat (hobuste EIAV, kitsede CAEV) või kopsu- ja ajukahjustusi (lammaste maedi/visna viirus MVV). Ainukese lentiviirusena levib putukate vahendusel EIAV, kuna temaga nakatunud loomadel tekib tugev plasma vireemia.
HTLV. Inimeste viirus, mis tekitab täiskasvanute leukeemiat. Selline leukeemia (ATL) võib esineda kroonilises või akuutses vormis. ATL areneb välja 1% nakatunutest 20-30 aastat peale nakatumist HTLVga, seega võib arvata et HTLV on ainult üheks soodustavaks faktoriks leukeemia väljaarenemisel. Antud hüpoteesi toetab ka leukeemiliste rakkude klonaalne päritolu. Akuutse leukeemiaga elavad patsiendid keskmiselt 6 kuud. Lisaks leukeemiale võib HTLVga olla seotud ka teatud müelopaatia tüüpi närvihaigused, võimalik et autoimmuunsuse tekke tõttu.
HTLV-I esineb kõige enam Jaapanis, Lõunamere saartel, Lääne-Aafrikas. HTLV-II esineb Ameerika mandri põliselanike hulgas ja viimasel ajal ka narkomaanide hulgas. Jaapanis arvatakse viiruse kandjateks 1% elanikkonnast, mujal vähem.
Viirus levib vere kaudu, analoogselt HIViga. Tema omapära on selles, et ta ei ole võimeline rakkudest eemalduma, seega saab nakatuda ainult juhul kui esineb kontakt nakatunu vererakkudega. Vereplasma ja sellest valmistatud toodete kaudu see viirus ei nakata. Kuna viirus on endeemiline, on peamiseks leviku teeks perekonnasisene ülekanne sugulisel teel ja ülekanne emalt lapsele rinnapiimaga. Seoses aktiivse programmiga, kus kõik viirusekandjad hoiduvad laste toitmisest piimaga, loodetakse viirusekandjate märgatavat vähenemist lähemata kümnendite jooksul.

Joonis 1512. HTLV poolt põhjustatud leukeemia akuutses faasis.

BLV. Lehmade leukeemiaviirus on inimeste HTLV lähedane sugulane. Paljuneb B-lümfotsüütides ja teistes vererakkudes. Põhjustab aeglaselt progresseeruvat leukoosi lehmadel. 5% lehmadest arenevad lümfoidse koe kasvajad. Levivad piimaga, veterinaarinstrumentide vahendusel ja soojemates maades ka putukatega.